MICROINYECCION
Las micro agujas miden
alrededor de 10 micrómetros. Pueden contener cerca de 15 micro litros de ADN.
Es similar a la sección transversal de un cabello humano. Es un método muy
preciso de transferencia génica. Requiere personal capacitado.
Los científicos pueden crear
simples organismos transgénicos inyectando genes dentro de los testículos de
nematodos en el punto en que las células que se convertirán en su esperma están
bajo el proceso de meiosis.
La micro inyección es usada
como un vector en la producción de plantas transgénicas.
La micro inyección de genes
dentro de óvulos fertilizados es un vector comúnmente utilizado en la
producción de animales transgénicos.
La micro inyección es un
proceso que consiste en utilizar micro agujas para insertar sustancias a un
nivel microscópico o en el límite de lo macroscópico dentro de una célula viva.
Es un simple proceso mecánico en el cual una aguja extremadamente fina penetra
la membrana celular y a veces la membrana nuclear para lanzar su contenido. La
micro inyección es normalmente realizada bajo un microscopio óptico llamado
micro manipulador. El proceso es frecuentemente usado como un vector en
ingeniería genética y transgenética para insertar material genético en una célula.
El proceso de clonación también involucra micro inyecciones.
ELECTROPORACION:
La electroporación o electro
permeabilización es un significativo aumento de la conductividad eléctrica y la
permeabilidad de la membrana plasmática celular causado por un campo eléctrico
aplicado externamente. Es habitual en biología molecular como forma de
introducción de diferentes sustancias en células, como por ejemplo sondas
moleculares, un fármaco que puede cambiar las funciones celulares o un
fragmento de DNA codificante, como puede ser un plásmido.
Cuando el voltaje que
atraviesa una membrana plasmática excede su rigidez dieléctrica se forman
poros. Si la fuerza del campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición
al mismo se eligen apropiadamente, los poros formados por el pulso eléctrico se
sellan tras un corto período, durante el cual los compuestos extracelulares
tienen la oportunidad de entrar a la célula. Sin embargo, una exposición
excesiva de células vivas a campos eléctricos puede causar apoptosis o
necrosis, procesos que provocan la muerte celular.
En biología molecular, el
proceso de electroporación es usado habitualmente para la transformación de
bacterias, levaduras y protoplastos vegetales. Además de membranas lipídicas,
las bacterias también tienen una pared celular compuestas de peptidoglicano y
sus derivados. Sin embargo, las paredes son porosas por naturaleza y sólo
actúan como corazas que protegen a la célula de impactos ambientales severos.
Si bacterias y plásmidos se mezclan los plásmidos pueden transferirse al
interior de las células tras la electroporación. En este proceso suelen
emplearse varios cientos de voltios, que atraviesan una distancia de varios
milímetros. A continuación, las células han de ser manipuladas cuidadosamente
hasta que tienen la oportunidad de dividirse, produciendo nuevas células que
contendrán copias del plásmido. Este proceso es aproximadamente diez veces más
efectivo que la transformación por métodos químicos.
Este procedimiento es
también altamente eficiente para la introducción de genes externos en células
en cultivo, especialmente en las de mamífero. Por ejemplo, se usa en el proceso
de producción de ratones knockout, así como en el tratamiento de tumores,
terapia génica y terapias basadas en células. El proceso de introducir ácidos
nucleicos externos en células eucariotas se conoce comotransfección.
BIOBALISTICA:
El término biobalística
deriva de la conjunción de “biología y balística” o “balística biológica”. Este
es un método muy original ideado y refinado en la década de 1980 por un grupo
de investigadores de la Universidad de Cornell (EE.UU.), que permite introducir
ADN a virtualmente cualquier tipo de célula. En este procedimiento el ADN es
introducido en las células por medio de partículas microscópicas
(macropartículas) aceleradas a velocidades supersónicas, que atraviesan la
pared y la membrana celular. Las partículas son aproximadamente esféricas (de
0.4 a 2.0 micrómetros de diámetro), están hechas de materiales densos como oro
o tungsteno (ver microfotografía 1 y 2, respectivamente), y se recubren con el
ADN que se desea transferir a las plantas. Para que las macropartículas pueda
atravesar las membranas celulares y llegar al núcleo de las células blanco, son
impulsadas a gran velocidad por explosión de pólvora seca, liberación de gas
comprimido a alta presión (aire, helio, CO2 o N2), o por una descarga eléctrica
de una gota de agua. Una vez dentro del tejido vegetal el ADN se desprende de
las macropartículas debido a las modificaciones del entorno iónico.
Si las partículas atraviesan
las membranas y son atrapadas en el núcleo, el ADN puede integrarse de forma
estable en los cromosomas mediante un proceso de recombinación al azar, lo que
se considera como transformación estable. La transformación estable ocurre a
muy baja frecuencia, por lo que es necesario utilizar un sistema de selección
in vitro (ver cuadernos Nº 5, 18 y 67) que permita distinguir células
transformadas y no transformadas.
En este método de
transformación las construcciones genéticas son más simples e incluyen los
genes de interés y de selección con sus secuencias regulatorias respectivas. El
ADN para ser clonado es incluido en plásmidos que son transferidos completos
durante el bombardeo a las células, o bien de forma de molécula lineal (el
plásmido cortado en un punto), a diferencia de los plásmidos utilizados con
Agrobacterium (plásmido ti desarmado). También es muy común que una vez
obtenida la construcción genética dentro de un plásmido (en el cual se clona y
se obtienen muchas copias para trabajar), luego se la extrae del mismo para
sólo tener la secuencia con los genes de interés y de selección (incluidas las
secuencias regulatorias) y así reducir el fragmento de ADN a transferir.
9.2.2 QUÍMICOS
MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO.
Basado en la obtención de un
precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. En esta situación coprecipitan
formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células.
Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las
nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el
éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios
en el pH de la solución, etc
MÉTODO DE LIPOSOMAS.
Se basa en la formación de
complejos entre lípidos catiónicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la
membrana y permite la entrada del DNA en el citosol. Una de las posibles vías
es la incorporación de liposomas a la membrana y la entrada flip-flap. Existen
un gran número de lípidos que se emplean en lipofección, aunque existe una
estructura consenso de un lípido catiónico sintético, a partir de la cual se
han diseñado muchas variantes (por ej. DOPE). Es esencial optimizar las
condiciones específicas de transfección para obtener buenas eficiencias, que
suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de la
placa. Las desventajas del método son, aparte del elevado precio de los
lípidos, el hecho de que no todos los lípidos funcionan en todos los tipos
celulares, y que hay que optimizar el ensayo para cada tipo celular. Los
parámetros a optimizar son la relación entre lípido y DNA (relación de cargas),
la cantidad de DNA empleado, el tiempo que se exponen las células al complejo y
la presencia o ausencia de suero.
BIBLIOGRAFIA
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