miércoles, 6 de junio de 2012

9.2 Mecanismos de transferencia artificial

9.2.1 FÍSICOS

MICROINYECCION

Las micro agujas miden alrededor de 10 micrómetros. Pueden contener cerca de 15 micro litros de ADN. Es similar a la sección transversal de un cabello humano. Es un método muy preciso de transferencia génica. Requiere personal capacitado.

Los científicos pueden crear simples organismos transgénicos inyectando genes dentro de los testículos de nematodos en el punto en que las células que se convertirán en su esperma están bajo el proceso de meiosis.
La micro inyección es usada como un vector en la producción de plantas transgénicas.
La micro inyección de genes dentro de óvulos fertilizados es un vector comúnmente utilizado en la producción de animales transgénicos.



La micro inyección es un proceso que consiste en utilizar micro agujas para insertar sustancias a un nivel microscópico o en el límite de lo macroscópico dentro de una célula viva. Es un simple proceso mecánico en el cual una aguja extremadamente fina penetra la membrana celular y a veces la membrana nuclear para lanzar su contenido. La micro inyección es normalmente realizada bajo un microscopio óptico llamado micro manipulador. El proceso es frecuentemente usado como un vector en ingeniería genética y transgenética para insertar material genético en una célula. El proceso de clonación también involucra micro inyecciones.



ELECTROPORACION:

La electroporación o electro permeabilización es un significativo aumento de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular causado por un campo eléctrico aplicado externamente. Es habitual en biología molecular como forma de introducción de diferentes sustancias en células, como por ejemplo sondas moleculares, un fármaco que puede cambiar las funciones celulares o un fragmento de DNA codificante, como puede ser un plásmido.


Cuando el voltaje que atraviesa una membrana plasmática excede su rigidez dieléctrica se forman poros. Si la fuerza del campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición al mismo se eligen apropiadamente, los poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto período, durante el cual los compuestos extracelulares tienen la oportunidad de entrar a la célula. Sin embargo, una exposición excesiva de células vivas a campos eléctricos puede causar apoptosis o necrosis, procesos que provocan la muerte celular.

En biología molecular, el proceso de electroporación es usado habitualmente para la transformación de bacterias, levaduras y protoplastos vegetales. Además de membranas lipídicas, las bacterias también tienen una pared celular compuestas de peptidoglicano y sus derivados. Sin embargo, las paredes son porosas por naturaleza y sólo actúan como corazas que protegen a la célula de impactos ambientales severos. Si bacterias y plásmidos se mezclan los plásmidos pueden transferirse al interior de las células tras la electroporación. En este proceso suelen emplearse varios cientos de voltios, que atraviesan una distancia de varios milímetros. A continuación, las células han de ser manipuladas cuidadosamente hasta que tienen la oportunidad de dividirse, produciendo nuevas células que contendrán copias del plásmido. Este proceso es aproximadamente diez veces más efectivo que la transformación por métodos químicos.

Este procedimiento es también altamente eficiente para la introducción de genes externos en células en cultivo, especialmente en las de mamífero. Por ejemplo, se usa en el proceso de producción de ratones knockout, así como en el tratamiento de tumores, terapia génica y terapias basadas en células. El proceso de introducir ácidos nucleicos externos en células eucariotas se conoce comotransfección.
BIOBALISTICA:
El término biobalística deriva de la conjunción de “biología y balística” o “balística biológica”. Este es un método muy original ideado y refinado en la década de 1980 por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell (EE.UU.), que permite introducir ADN a virtualmente cualquier tipo de célula. En este procedimiento el ADN es introducido en las células por medio de partículas microscópicas (macropartículas) aceleradas a velocidades supersónicas, que atraviesan la pared y la membrana celular. Las partículas son aproximadamente esféricas (de 0.4 a 2.0 micrómetros de diámetro), están hechas de materiales densos como oro o tungsteno (ver microfotografía 1 y 2, respectivamente), y se recubren con el ADN que se desea transferir a las plantas. Para que las macropartículas pueda atravesar las membranas celulares y llegar al núcleo de las células blanco, son impulsadas a gran velocidad por explosión de pólvora seca, liberación de gas comprimido a alta presión (aire, helio, CO2 o N2), o por una descarga eléctrica de una gota de agua. Una vez dentro del tejido vegetal el ADN se desprende de las macropartículas debido a las modificaciones del entorno iónico.
Si las partículas atraviesan las membranas y son atrapadas en el núcleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un proceso de recombinación al azar, lo que se considera como transformación estable. La transformación estable ocurre a muy baja frecuencia, por lo que es necesario utilizar un sistema de selección in vitro (ver cuadernos Nº 5, 18 y 67) que permita distinguir células transformadas y no transformadas.
En este método de transformación las construcciones genéticas son más simples e incluyen los genes de interés y de selección con sus secuencias regulatorias respectivas. El ADN para ser clonado es incluido en plásmidos que son transferidos completos durante el bombardeo a las células, o bien de forma de molécula lineal (el plásmido cortado en un punto), a diferencia de los plásmidos utilizados con Agrobacterium (plásmido ti desarmado). También es muy común que una vez obtenida la construcción genética dentro de un plásmido (en el cual se clona y se obtienen muchas copias para trabajar), luego se la extrae del mismo para sólo tener la secuencia con los genes de interés y de selección (incluidas las secuencias regulatorias) y así reducir el fragmento de ADN a transferir.
9.2.2 QUÍMICOS
MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO.
Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de  fosfatos. En esta situación coprecipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc
MÉTODO DE LIPOSOMAS.
Se basa en la formación de complejos entre lípidos catiónicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el citosol. Una de las posibles vías es la incorporación de liposomas a la membrana y la entrada flip-flap. Existen un gran número de lípidos que se emplean en lipofección, aunque existe una estructura consenso de un lípido catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado muchas variantes (por ej. DOPE). Es esencial optimizar las condiciones específicas de transfección para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de la placa. Las desventajas del método son, aparte del elevado precio de los lípidos, el hecho de que no todos los lípidos funcionan en todos los tipos celulares, y que hay que optimizar el ensayo para cada tipo celular. Los parámetros a optimizar son la relación entre lípido y DNA (relación de cargas), la cantidad de DNA empleado, el tiempo que se exponen las células al complejo y la presencia o ausencia de suero.
BIBLIOGRAFIA

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